Dra. Vanesa Gottifredi
Jefa de Laboratorio
Ciclo Celular y Estabilidad Genómica English version
Temas
Las terapias contra el cáncer fallan cuando las células cancerosas se adaptan al tratamiento debido al aprovechamiento de mecanismo de adaptación está íntimamente relacionado con la capacidad de replicar (duplicación) el ADN en condiciones adversas. El objetivo de nuestro laboratorio es identificar métodos para perturbar de forma potente y selectiva la replicación del ADN de las células cancerosas, evitando así su multiplicación.
Trabajamos bajo la hipótesis de que la replicación del ADN es un blanco terapéutico contra el cáncer. Cuando el ADN es dañado, por ejemplo, por quimioterapia, las células normales evitan duplicar su ADN, pero las células cancerosas utilizan los templados dañados como molde para copiar ADN. Esto crea una ventana de oportunidad para el desarrollo de tratamientos: si la quimioterapia reduce la calidad de los templados de ADN por debajo de un umbral aceptable, la duplicación del ADN puede detenerse irreversiblemente y al no poder completarse, desencadenar muerte celular. Pero décadas de uso de quimioterapia en seres humanos han revelado que dicho presupuesto no es tan alcanzable como se esperaba inicialmente. Tal limitación es consecuencia de la activación de una red molecular, la respuesta al ADN dañado o DDR (del inglés, DNA damage response), que permite la utilización de templados de ADN dañado como moldes replicativos. Dicha red es esencial para propiciar la sobrevida de células sanas ante estrés metabólico o ambiental; desafortunadamente, las células cancerosas también aprovechan esa DDR para completar la replicación del ADN dañado, sobrevivir y adaptarse a la quimioterapia.
El objetivo principal de nuestro laboratorio es el de dilucidar la contribución de diferentes factores de DDR a la supervivencia de las células cancerosas y a su capacidad de adaptación al tratamiento. Buscamos además interpretar dicho conocimiento en el marco de la identificación de dianas farmacológicamente regulables que sensibilizan selectivamente las células cancerosas a la muerte celular y/o inhiben la adaptación tumoral a la quimioterapia.
Enfoque
Las herramientas de biología molecular y biología celular de diferentes tipos son fundamentales para nuestra investigación. El sistema modelo que nos permite recapitular la respuesta de las células tumorales al tratamiento son las líneas de células cancerígenas en cultivos in vitro. Aunque simplificadas y artificiales en cuanto a su capacidad de recapitular la complejidad de tejido tumoral, las células cancerosas en cultivo son fáciles de manipular, pudiéndose alterar la expresión de genes específicos con protocolos sencillos. El hacerlo nos permite establecer relaciones causales entre la eliminación/inactivación de un determinado gen y el cambio en una variable funcionalmente relevante. Para revelar variables claves en la red molecular objeto de nuestro estudio, monitoreamos: la replicación del ADN a diferentes niveles, incluida la evaluación de: moléculas individuales de ADN recién sintetizado (Figura 1), diferentes marcadores directos o indirectos de daño del ADN (Figura 2), parámetros de inestabilidad en cromosomas (Figura 3). y muerte celular (Figura 4) entre otros marcadores. Al analizar dichos parámetros, inferimos el potencial efecto terapéutico que pudiese tener la inhibición de un factor celular dado, en cuanto a su capacidad de inducir muerte celular o de prevenir la adaptabilidad de la célula cancerosa al tratamiento.
Las terapias contra el cáncer fallan cuando las células cancerosas se adaptan al tratamiento debido al aprovechamiento de mecanismo de adaptación está íntimamente relacionado con la capacidad de replicar (duplicación) el ADN en condiciones adversas. El objetivo de nuestro laboratorio es identificar métodos para perturbar de forma potente y selectiva la replicación del ADN de las células cancerosas, evitando así su multiplicación.
Trabajamos bajo la hipótesis de que la replicación del ADN es un blanco terapéutico contra el cáncer. Cuando el ADN es dañado, por ejemplo, por quimioterapia, las células normales evitan duplicar su ADN, pero las células cancerosas utilizan los templados dañados como molde para copiar ADN. Esto crea una ventana de oportunidad para el desarrollo de tratamientos: si la quimioterapia reduce la calidad de los templados de ADN por debajo de un umbral aceptable, la duplicación del ADN puede detenerse irreversiblemente y al no poder completarse, desencadenar muerte celular. Pero décadas de uso de quimioterapia en seres humanos han revelado que dicho presupuesto no es tan alcanzable como se esperaba inicialmente. Tal limitación es consecuencia de la activación de una red molecular, la respuesta al ADN dañado o DDR (del inglés, DNA damage response), que permite la utilización de templados de ADN dañado como moldes replicativos. Dicha red es esencial para propiciar la sobrevida de células sanas ante estrés metabólico o ambiental; desafortunadamente, las células cancerosas también aprovechan esa DDR para completar la replicación del ADN dañado, sobrevivir y adaptarse a la quimioterapia.
El objetivo principal de nuestro laboratorio es el de dilucidar la contribución de diferentes factores de DDR a la supervivencia de las células cancerosas y a su capacidad de adaptación al tratamiento. Buscamos además interpretar dicho conocimiento en el marco de la identificación de dianas farmacológicamente regulables que sensibilizan selectivamente las células cancerosas a la muerte celular y/o inhiben la adaptación tumoral a la quimioterapia.
Enfoque
Las herramientas de biología molecular y biología celular de diferentes tipos son fundamentales para nuestra investigación. El sistema modelo que nos permite recapitular la respuesta de las células tumorales al tratamiento son las líneas de células cancerígenas en cultivos in vitro. Aunque simplificadas y artificiales en cuanto a su capacidad de recapitular la complejidad de tejido tumoral, las células cancerosas en cultivo son fáciles de manipular, pudiéndose alterar la expresión de genes específicos con protocolos sencillos. El hacerlo nos permite establecer relaciones causales entre la eliminación/inactivación de un determinado gen y el cambio en una variable funcionalmente relevante. Para revelar variables claves en la red molecular objeto de nuestro estudio, monitoreamos: la replicación del ADN a diferentes niveles, incluida la evaluación de: moléculas individuales de ADN recién sintetizado (Figura 1), diferentes marcadores directos o indirectos de daño del ADN (Figura 2), parámetros de inestabilidad en cromosomas (Figura 3). y muerte celular (Figura 4) entre otros marcadores. Al analizar dichos parámetros, inferimos el potencial efecto terapéutico que pudiese tener la inhibición de un factor celular dado, en cuanto a su capacidad de inducir muerte celular o de prevenir la adaptabilidad de la célula cancerosa al tratamiento.
Figura 1: Ensayo de extensión de fibra de ADN y revelado de moléculas de ADN recién sintetizado. A) Las células son marcadas con dos pulsos consecutivos y de igual duración de dos análogos de timidina. B) Las células se tripsinizan y se lisan sobre un portaobjetos. El portaobjetos se inclina para que la gota con las células lisadas recorra el vidrio por acción de la gravedad y se estiren las fibras de ADN. C) Por último, las fibras se revelan por inmunotinciones. D) Panel representativo de una extensión de fibras (Speroni et al., PNAS, 2012). E) Panel representativo de fibras únicas mostrando las distintas estructuras que pueden ser evidenciadas en el ensayo (paneles A-C y E corresponden al manuscrito de tesis doctoral de Nicolás Calzetta).
Figura 2: Ejemplos de marcadores directos e indirectos de daño al ADN. A) Marcación focal y pan nuclear de la histona H2AX fosforilada (γH2AX) que indican respectivamente sitios de acumulación de ADN dañado y células comprometidas a muerte celular por estrés replicativo extremo. B) Acumulación focal de γH2AX en células en mitosis con cromosomas condesados. C) Formación de “colas de cometa” en núcleos sometidos a electroforesis para revelar acumulación de cortes en la doble cadena de ADN que reducen el peso molecular del ADN y permiten su migración. D) Extendido metafásico (ADN marcado en rojo) combinado con marcación de ADN sintetizado durante la fase M (revelado por marcación con el análogo de timina-EdU-evidenciado en color verde). Las fotos en B y C corresponden a la publicación Calzetta et al, 2020, Sci Adv.
Figura 3: Ejemplos de parámetros de inestabilidad cromosómica. A) Defectos de segregación de cromosomas revelados al analizar la organización de metafases. B) puentes ultrafinos que revelan la acumulación de regiones de ADN no duplicadas al final de la metafase. C) formación de micronúcleos, estructuras perinucleares con pedazos de cromosomas o cromosomas enteros que no fueron reclutados a la placa metafásica durante la mitosis. D) extendido cromosómico que muestran acumulación de cromosomas aberrantes. Las fotos en A-B corresponden a la publicación Calzetta et al., 2020, Sci Adv y las de C-D a Federico et al., 2016, PloS Genetics.
Avances.
Las células cancerosas se adaptan al daño del ADN causado por la quimioterapia activando vías moleculares que incluyen a la síntesis de ADN por translesión (TLS), mecanismo que previene la detención persistente de horquillas replicativas en regiones ricas en ADN dañado. Durante un evento de TLS, las polimerasas replicativas estancadas en barreras replicativas son reemplazadas por polimerasas de TLS que poseen la habilidad de acomodar bases dañadas en su sitio activo. Hemos demostrado que el inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas, p21, es un regulador negativo de TLS (Figura 4). Específicamente, el dominio C-terminal de p21 se une a la plataforma de carga de la polimerasa de ADN, PCNA (antígeno nuclear de células proliferativas), desplazando a las polimerasas de TLS del replisoma (Soria et al, 2006 JCS). En células no dañadas, p21 evita la participación desregulada de polimerasas TLS en la duplicación de ADN no dañado (Mansilla et al, eLIFE 2016). Pero cuando aumenta el daño del ADN, quizás como consecuencia de la quimioterapia, se necesita activar a TLS y se registra un aumento en la degradación de p21 (Soria et al, 2006 JCS; Mansilla et al, Nucleic Acid Research 2013). La expresión estable de un mutante de p21 refractario a la degradación provoca la muerte celular en células que sufren altos niveles de daño en el ADN. Por lo tanto, la sobreexpresión de p21 o la regulación negativa de TLS son candidatos válidos para desarrollar herramientas que puedan mejorar tratamientos basados en la acumulación de daño al ADN.
Avances.
Las células cancerosas se adaptan al daño del ADN causado por la quimioterapia activando vías moleculares que incluyen a la síntesis de ADN por translesión (TLS), mecanismo que previene la detención persistente de horquillas replicativas en regiones ricas en ADN dañado. Durante un evento de TLS, las polimerasas replicativas estancadas en barreras replicativas son reemplazadas por polimerasas de TLS que poseen la habilidad de acomodar bases dañadas en su sitio activo. Hemos demostrado que el inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas, p21, es un regulador negativo de TLS (Figura 4). Específicamente, el dominio C-terminal de p21 se une a la plataforma de carga de la polimerasa de ADN, PCNA (antígeno nuclear de células proliferativas), desplazando a las polimerasas de TLS del replisoma (Soria et al, 2006 JCS). En células no dañadas, p21 evita la participación desregulada de polimerasas TLS en la duplicación de ADN no dañado (Mansilla et al, eLIFE 2016). Pero cuando aumenta el daño del ADN, quizás como consecuencia de la quimioterapia, se necesita activar a TLS y se registra un aumento en la degradación de p21 (Soria et al, 2006 JCS; Mansilla et al, Nucleic Acid Research 2013). La expresión estable de un mutante de p21 refractario a la degradación provoca la muerte celular en células que sufren altos niveles de daño en el ADN. Por lo tanto, la sobreexpresión de p21 o la regulación negativa de TLS son candidatos válidos para desarrollar herramientas que puedan mejorar tratamientos basados en la acumulación de daño al ADN.
Figura 4: La función primaria de p21 no es la inhibición de quinasas dependientes de ciclinas. El inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas realiza dicha función solo cuando los niveles de p21 aumentan en manera abrupta en manera no compatible con la proliferación celular. En contraposición, los niveles bajos de p21 que se detectan durante la replicación de ADN promueven la replicación previniendo el cargado de polimerasas de TLS que son más ineficientes y menos fieles. Cuando se acumula daño en el ADN dichos niveles bajos de p21 deben eliminarse para promover TLS. (Mansilla et al. Genes 2020)
También hemos participado en el nodo de validación de un consorcio público-privado en el que colaboramos con GlaxoSmithKline que realizó un screening diseñado para evaluar la habilidad de diferentes inhibidores de quinasas para matar selectivamente células deficientes en los supresores tumorales BRCA1 y 2 (la mutación de los supresores tumorales BRCA se asocia frecuentemente con la génesis de cánceres de mama triple negativos). El nodo de screening identificó inhibidores de quinasas que causan muerte celular selectiva, ya sea en células deficientes en BRCA1 (inhibición de PLK1) (Carbajosa et al, 2019) o BRCA2 (resultados no publicados). En nuestro laboratorio, exploramos el mecanismo de acción de tales inhibidores de quinasa. Descubrimos que el mecanismo de acción de estos nuevos blancos potenciales es diferente al mecanismo de muerte celular causado por los inhibidores de PARP (del inglés, Poly-ADP ribose polymerase), fármaco que están actualmente disponibles para tratar estos tipos de cánceres. Sorprendentemente, mientras que los inhibidores de PARP provocan la acumulación de marcadores de inestabilidad cromosómica, la inhibición de PLK1 no lo hace. Investigaremos más a fondo si tal limite en la acumulación de cambios en el genoma (potencialmente adaptativos) representa una oportunidad para mejorar el tratamiento.
También hemos participado en el nodo de validación de un consorcio público-privado en el que colaboramos con GlaxoSmithKline que realizó un screening diseñado para evaluar la habilidad de diferentes inhibidores de quinasas para matar selectivamente células deficientes en los supresores tumorales BRCA1 y 2 (la mutación de los supresores tumorales BRCA se asocia frecuentemente con la génesis de cánceres de mama triple negativos). El nodo de screening identificó inhibidores de quinasas que causan muerte celular selectiva, ya sea en células deficientes en BRCA1 (inhibición de PLK1) (Carbajosa et al, 2019) o BRCA2 (resultados no publicados). En nuestro laboratorio, exploramos el mecanismo de acción de tales inhibidores de quinasa. Descubrimos que el mecanismo de acción de estos nuevos blancos potenciales es diferente al mecanismo de muerte celular causado por los inhibidores de PARP (del inglés, Poly-ADP ribose polymerase), fármaco que están actualmente disponibles para tratar estos tipos de cánceres. Sorprendentemente, mientras que los inhibidores de PARP provocan la acumulación de marcadores de inestabilidad cromosómica, la inhibición de PLK1 no lo hace. Investigaremos más a fondo si tal limite en la acumulación de cambios en el genoma (potencialmente adaptativos) representa una oportunidad para mejorar el tratamiento.
Figura 5: El aumento de estrés replicativo no es una condición necesaria para causar la muerte celular en células deficientes en BRCA1. Mientras que los inhibidores de PARP causan aumento de marcadores de estrés replicativo como focos nucleares de γH2AX, 53BP1 e inestabilidad cromosómica revelado como acumulación de micronúcleos y cromosomas aberrantes, la inhibición de PLK1 causa una muerte celular libre de estos parámetros.
Además, utilizamos un modelo de regulación negativa de la quinasa Chk1 para explorar los mecanismos de muerte celular y la inestabilidad genómica causada por la inhibición de DDR. Elegimos bloquear a Chk1 porque las células cancerosas dependen en gran medida de esta enzima para llevar adelante un ciclo de replicación exitoso. Encontramos que la inhibición de Chk1 no solo inhibe la actividad quinasa de Chk1, sino que también provoca la formación de barreras de replicación mediadas por el aumento del reclutamiento al ADN de CDC45, un componente del complejo de activación de orígenes de replicación. También demostramos que dichas barreras de replicación contribuyen a desencadenar muerte celular en células deficientes para Chk1 (González Besteiro et al., EMBO, 2019). Dicha muerte celular está precedida por la formación de roturas en la doble cadena de ADN durante la etapa de síntesis de ADN. Sorprendentemente, dicha muerte celular se separa a nivel molecular de la inducción de inestabilidad cromosómica disparada por la reducción en la expresión de causa de la inestabilidad cromosómica es la síntesis de ADN aberrante en la fase M, que se puede revertirse tras el agregando nucleósidos adicionales. La implicación de estos descubrimientos es que, al separarse inestabilidad cromosómica y muerte, es posible prevenir lo primero sin afectar lo segundo, limitando de esa manera los cambios genéticos que podrían generar adaptabilidad en la población que sobrevivió al tratamiento (Calzetta et al., Sci Adv., 2020).
Además, utilizamos un modelo de regulación negativa de la quinasa Chk1 para explorar los mecanismos de muerte celular y la inestabilidad genómica causada por la inhibición de DDR. Elegimos bloquear a Chk1 porque las células cancerosas dependen en gran medida de esta enzima para llevar adelante un ciclo de replicación exitoso. Encontramos que la inhibición de Chk1 no solo inhibe la actividad quinasa de Chk1, sino que también provoca la formación de barreras de replicación mediadas por el aumento del reclutamiento al ADN de CDC45, un componente del complejo de activación de orígenes de replicación. También demostramos que dichas barreras de replicación contribuyen a desencadenar muerte celular en células deficientes para Chk1 (González Besteiro et al., EMBO, 2019). Dicha muerte celular está precedida por la formación de roturas en la doble cadena de ADN durante la etapa de síntesis de ADN. Sorprendentemente, dicha muerte celular se separa a nivel molecular de la inducción de inestabilidad cromosómica disparada por la reducción en la expresión de causa de la inestabilidad cromosómica es la síntesis de ADN aberrante en la fase M, que se puede revertirse tras el agregando nucleósidos adicionales. La implicación de estos descubrimientos es que, al separarse inestabilidad cromosómica y muerte, es posible prevenir lo primero sin afectar lo segundo, limitando de esa manera los cambios genéticos que podrían generar adaptabilidad en la población que sobrevivió al tratamiento (Calzetta et al., Sci Adv., 2020).
Figura 6: La relación entre inestabilidad genómica y muerte celular después de tratamientos anti-cáncer. A) está aceptado que la muerte celular y la inestabilidad genómica están inducidas por las mismas señales moleculares, siendo la inestabilidad genómica uno de los eventos que precede la muerte celular. B) Demostramos que al regular negativamente al blanco terapéutico Chk1, la inestabilidad genómica y la muerte celular están separadas a nivel molecular pudiendo inhibirse una u otra en manera selectiva.