Dra. Angeles Zorreguieta
Jefa de Laboratorio
Microbiología Molecular y Celular English version
Tema
Las bacterias han desarrollado diferentes estrategias tales como la formación de biofilms y la secreción de proteínas que les permiten colonizar exitosamente distintos hábitats tanto fuera como dentro de sus hospedadores. Intentamos descifrar estos mecanismos utilizando como modelos de estudios dos alfa-proteobacterias: Rhizobium que establece relaciones simbióticas con las plantas leguminosas permitiéndoles asimilar el nitrógeno atmosférico y Brucella, un patógeno intracelular que produce una enfermedad zoonótica conocida como brucelosis.
Nos interesa identificar y caracterizar los factores involucrados en el ensamblado de la matriz extracelular y la cohesión entre bacterias de los biofilms de los rizobios. En particular, estamos dedicados en tratar de comprender el rol de las proteínas extracelulares Rap que comparten un dominio de unión al exopolisacárido acídico (EPS), componente clave del biofilm.
La interacción inicial a las células es un paso crucial en la infección de patógenos intracelulares. ¿Cuáles son los factores proteicos que median la adhesión a las múltiples células que Brucella es capaz de infectar? ¿cómo se asegura la correcta inserción de estas proteínas en la envoltura celular? ¿Cómo se regula la expresión de las adhesinas?
Enfoque
Para analizar la función de los factores de la envoltura o extracelulares en la formación de biofilms y en la interacción con el hospedador llevamos adelante estudios fenotípicos, proteómicos y funcionales de mutantes o sobre-expresantes de dichos factores tanto in vitro como in vivo. Aplicamos la microscopía confocal para estudiar la cohesión celular, la formación de biofilms y determinar la localización extracelular de dichos factores. También realizamos análisis genómicos, transcriptómicos y aplicamos métodos bioinformáticos para estudiar la regulación de las adhesinas y determinar cuáles son los factores transcripcionales y estímulos ambientales que impactan en su expresión. Para comprender el modo de acción de las proteínas en estudio abordamos estudios estructurales o funcionales utilizando proteínas recombinantes expresadas en forma heteróloga.
Avances
Biofilms en Rhizobium:
Para la formación de biofilms y la adhesión a superficies abióticas y sobre la raíz se requiere la producción del exopolisacárido acídico (EPS), la parte expuesta del lipopolisacárido (LPS) y la secreción de las proteínas Rap a través del sistema tipo I PrsDE. Mostramos que RapA2, formada solamente por dos dominios Ra/CHDL (Ra1-Ra2), presenta una estructura tipo cadherina de hoja β dependiente de calcio. En su conformación nativa se une a una estructura específica de las cadenas crecientes de EPS rica en ácido glucurónico. Las lectinas RapA estuvieron implicadas en el desarrollo de la matriz de biofilm y en la cohesión celular modulando el tamaño de las cadenas de EPS y el balance entre el polisacárido capsular y el EPS.
Adhesión al hospedador y envoltura celular en Brucella:
Demostramos que Brucella expresa cinco adhesinas de las familias de los autotransportadores (dos triméricas y tres monoméricas clásicas) que cumplen funciones redundantes o complementarias en la adhesión del patógeno a la matriz extracelular, a diferentes tipo celulares y la virulencia. Estas adhesinas no se localizan al azar en la superficie bacteriana, sino que lo hacen en una región polar definida que conforma un verdadero “polo adhesivo”.
En un trabajo reciente observamos que BmaB, uno de los autotransportadores monoméricos, requiere de la maquinaria conocida como TAM (translocation and assembly module) para ensamblarse y ejercer su función biológica. En Brucella y otras alfa-proteobacterias, TAM (o Map como lo denominamos) no sólo es necesario para el correcto ensamblado del autotransportador sino que cumple una función crucial en la estabilidad y biogénesis de la envoltura celular de manera coordinada con la división celular.
Con respecto a la regulación de las adhesinas, observamos que la expresión del autotransportador trimérico BtaE está integrada a una compleja red transcripcional que involucra a otros factores de virulencia y responde directamente a reguladores que integran señales metabólicas y ambientales.
Recientemente, en colaboración con el grupo de Pablo Baldi y Mariana Ferrero (IDEHU, FFyB UBA) se evaluó la respuesta inmune y la protección frente al desafío de la mucosa inducida por la vacunación nasal con el dominio soluble de BtaF recombinante. Aunque la inmunización nasal con BtaF no protegió a los ratones contra el desafío respiratorio de Brucella suis, confirió una protección muy marcada al desafío intragástrico.
Las bacterias han desarrollado diferentes estrategias tales como la formación de biofilms y la secreción de proteínas que les permiten colonizar exitosamente distintos hábitats tanto fuera como dentro de sus hospedadores. Intentamos descifrar estos mecanismos utilizando como modelos de estudios dos alfa-proteobacterias: Rhizobium que establece relaciones simbióticas con las plantas leguminosas permitiéndoles asimilar el nitrógeno atmosférico y Brucella, un patógeno intracelular que produce una enfermedad zoonótica conocida como brucelosis.
Nos interesa identificar y caracterizar los factores involucrados en el ensamblado de la matriz extracelular y la cohesión entre bacterias de los biofilms de los rizobios. En particular, estamos dedicados en tratar de comprender el rol de las proteínas extracelulares Rap que comparten un dominio de unión al exopolisacárido acídico (EPS), componente clave del biofilm.
La interacción inicial a las células es un paso crucial en la infección de patógenos intracelulares. ¿Cuáles son los factores proteicos que median la adhesión a las múltiples células que Brucella es capaz de infectar? ¿cómo se asegura la correcta inserción de estas proteínas en la envoltura celular? ¿Cómo se regula la expresión de las adhesinas?
Enfoque
Para analizar la función de los factores de la envoltura o extracelulares en la formación de biofilms y en la interacción con el hospedador llevamos adelante estudios fenotípicos, proteómicos y funcionales de mutantes o sobre-expresantes de dichos factores tanto in vitro como in vivo. Aplicamos la microscopía confocal para estudiar la cohesión celular, la formación de biofilms y determinar la localización extracelular de dichos factores. También realizamos análisis genómicos, transcriptómicos y aplicamos métodos bioinformáticos para estudiar la regulación de las adhesinas y determinar cuáles son los factores transcripcionales y estímulos ambientales que impactan en su expresión. Para comprender el modo de acción de las proteínas en estudio abordamos estudios estructurales o funcionales utilizando proteínas recombinantes expresadas en forma heteróloga.
Avances
Biofilms en Rhizobium:
Para la formación de biofilms y la adhesión a superficies abióticas y sobre la raíz se requiere la producción del exopolisacárido acídico (EPS), la parte expuesta del lipopolisacárido (LPS) y la secreción de las proteínas Rap a través del sistema tipo I PrsDE. Mostramos que RapA2, formada solamente por dos dominios Ra/CHDL (Ra1-Ra2), presenta una estructura tipo cadherina de hoja β dependiente de calcio. En su conformación nativa se une a una estructura específica de las cadenas crecientes de EPS rica en ácido glucurónico. Las lectinas RapA estuvieron implicadas en el desarrollo de la matriz de biofilm y en la cohesión celular modulando el tamaño de las cadenas de EPS y el balance entre el polisacárido capsular y el EPS.
Adhesión al hospedador y envoltura celular en Brucella:
Demostramos que Brucella expresa cinco adhesinas de las familias de los autotransportadores (dos triméricas y tres monoméricas clásicas) que cumplen funciones redundantes o complementarias en la adhesión del patógeno a la matriz extracelular, a diferentes tipo celulares y la virulencia. Estas adhesinas no se localizan al azar en la superficie bacteriana, sino que lo hacen en una región polar definida que conforma un verdadero “polo adhesivo”.
En un trabajo reciente observamos que BmaB, uno de los autotransportadores monoméricos, requiere de la maquinaria conocida como TAM (translocation and assembly module) para ensamblarse y ejercer su función biológica. En Brucella y otras alfa-proteobacterias, TAM (o Map como lo denominamos) no sólo es necesario para el correcto ensamblado del autotransportador sino que cumple una función crucial en la estabilidad y biogénesis de la envoltura celular de manera coordinada con la división celular.
Con respecto a la regulación de las adhesinas, observamos que la expresión del autotransportador trimérico BtaE está integrada a una compleja red transcripcional que involucra a otros factores de virulencia y responde directamente a reguladores que integran señales metabólicas y ambientales.
Recientemente, en colaboración con el grupo de Pablo Baldi y Mariana Ferrero (IDEHU, FFyB UBA) se evaluó la respuesta inmune y la protección frente al desafío de la mucosa inducida por la vacunación nasal con el dominio soluble de BtaF recombinante. Aunque la inmunización nasal con BtaF no protegió a los ratones contra el desafío respiratorio de Brucella suis, confirió una protección muy marcada al desafío intragástrico.